黃曲霉毒素是一種肝臟毒素，對人和許多動物都有極強的致癌性，其中黃曲霉毒素B1毒性最大，致癌性最強。因此，食品中黃曲霉毒素B1的檢測是非常重要的。下面介紹的分離及測定黃曲霉毒素的方法——薄層色譜法（TLC）是常規分析中常用的一種重要方法。
　　一、 原理
　　樣品中黃曲霉毒素B1經提取、濃縮、薄層分離后，在波長365nm紫外光下產生藍紫色熒光，根據其在薄層上顯示熒光的最低檢出量來測定含量。
　　二、 試劑
　　（一） 三氯甲烷。
　　（二） 石油醚（沸程30℃~60℃或60℃~90℃）。
　　（三） 甲醇。
　　（四） 苯。
　　（五） 乙腈。
　　（六） 無水乙醚或乙醚經無水硫酸鈉脫水。
　　（七） 丙酮。
　　以上試劑在試驗時先進行1次試劑空白試驗，如不干擾測定即可使用，否則逐一檢查進行重蒸。
　　（八） 苯-乙腈混合液：量取98mL苯，加2mL乙腈，混勻。
　　（九） 硅膠G：薄層色譜用。
　　（十） 三氟乙酸。
　　（十一） 無水硫酸鈉。
　　（十二） 黃曲霉毒素B1標準溶液。
　　1． 貯備液的制備：精密稱取1mg~1.2mg的黃曲霉毒素B1標準品，先加入2mL乙腈溶解后，再用苯稀釋至100mL，避光，置于4℃冰箱保存。該標準溶液約為10μg/mL。用紫外分光光度計測此標準溶液的最大吸收峰的波長及該波長的吸光度值，并按下式計算此標準溶液的濃度。 式中：X1黃曲霉毒素B1標準溶液的濃度，μg/mL；A——測得的吸光度值；312——黃曲霉毒素B1的分子量；19800——黃曲霉毒素B1在苯-乙腈混合液中的摩爾消光系統；f——使用儀器校正因素；用c（K2Cr2O7）=0.0004mol/L，c（K2Cr2O7）=0.002mol/L，c（K2Cr2O7）=0.0001mol/L三種溶液，以1cm石英杯，在最大吸收峰的波長（接近350mm）處用硫酸溶液（0.5mL硫酸+1000mL水）作空白，測以上三種溶液的吸光度（A），并按式E=A/c計算平均摩爾消光系數，再按式f=3160/E求出使用儀器的校正因素。若f大于0.95或小于1.05，則使用儀器的校正因素可略而不計。
　　根據計算，用苯-乙腈（98+2）混合液調到標準溶液濃度恰為10μg/mL，并用分光光度計核對其濃度。
　　2． 純度的測定：取5μL（10μg/mL）黃曲霉毒素B1標準溶液，滴加于薄層板上，用甲醇-三氯甲烷（4+96）與丙酮-三氯甲烷（8+92）展開劑展開，在紫外燈下觀察熒光的產生：只有單一的熒光點，無其他雜質熒光點，原點上沒有任何殘留的熒光物質。
　　（十三） 黃曲霉毒素B1標準使用液：用苯-乙腈混合液準確稀釋標準溶液至每毫升相當于0.2μg及0.04μg黃曲霉毒素B1。
　　三、 儀器
　　（一） 分光光度計。
　　（二） 烘箱。
　　（三） 索氏抽提器。
　　（四） 電熱恒溫水浴。
　　（五） 電動振蕩器。
　　（六） 玻璃板：5cm×20cm
　　（七） 薄層板涂布器。
　　（八） 展開槽：內長25cm寬6cm、高4cm。
　　（九） 紫外光燈：100W~125W，帶有波長365nm濾光片。
　　（十） 微量注射器。
　　四、 操作步驟
　　由于月餅類糕點中含有大量油脂，為了使測定結果更準確，必須先除去油脂后再進行測定。因黃曲霉毒素易溶解在油脂中，為了達到既要除去油脂便于測定，又要保證樣品中含有的黃曲霉毒素不被油脂帶走而造成測定結果偏差。因此，應先將黃曲霉毒素從油脂中“趕”出來，然后再除去油脂。根據黃曲霉毒素不溶在乙醚或石油醚中，而油脂易溶于其中的特性，用乙醚或石油醚除去油脂就可達到目的。
　　（一） 去油脂
　　稱取20g樣品，放入濾紙筒內，筒兩端塞以少許脫脂棉，置于索氏抽提器內，在250mL油脂瓶內加入180mL-200mL石油醚，于70℃~80℃水浴上加熱回流提取油脂，抽提6h以上。除油脂完畢后，將濾紙筒取出放在瓷盤中避光自燃揮干備用，回收石油醚。
　　（二） 提取
　　將濾紙筒內除去油脂后的樣品轉入250mL具塞錐形瓶中，用6mL水濕潤，準確加入60mL三氯甲烷，在瓶塞上涂上一層水，蓋嚴，振搖30min，加入12g無水硫酸鈉脫水，靜置30min以上，用快速定性濾紙過濾于100mL具塞錐形瓶中，取12.00mL 濾液（相當4g）樣品）于蒸發皿中，在65℃水浴上于通風柜內揮干，然后放在冰盒上冷卻2min~3min后，準確加入1mL苯-乙腈（98+2）混合液。用帶橡皮頭的滴管的管尖將殘渣充分混合，若有苯的結晶析出，將蒸發皿從冰盒上取下，繼續溶解、混合，晶體即消失，再用此滴管吸取上清液轉移于2mL具塞試管中蓋嚴備用。
　　（三） 測定
　　1． 薄層板的制備
　　稱取約3g硅膠G，加入2~3倍左右的水，涂成5cm×20cm的薄層板三塊。在空氣中干燥約15min后，置100℃活化2h。
　　2． 點樣
　　在距薄層板下端3cm的基線上用微量注射器滴加樣液。一塊板可滴加4個點，點距邊緣和點間距約為1cm，點直徑約3mm。在同一板上滴加點的大小應一致，滴加時可用吹風機用冷風邊吹邊加。滴加樣式如下：
　　第一點：10μL（0.04μg/mL）黃曲霉毒素B1標準使用液。
　　第二點20μL樣液。
　　3． 展開與觀察
　　在展開槽內加10mL無水乙醚，預展12cm，取出揮干。再于另一展開槽內加10mL丙酮-三氯甲烷（8+92），展開10cm，取出揮干后在365nm紫外光下觀察結果。如果第二點在與第一點相同的比移值位置上無藍紫色熒光點，表示樣品中黃曲霉毒素B1含量在5μg/kg以下；如在相應位置上有藍紫色熒光點，則需進行確證試驗。
　　4． 確證實驗
　　于薄層板左邊依次滴加兩個點。
　　第一點：10μL（0.04μg/mL）黃曲霉毒素B1標準使用液。
　　第二點：20μL樣液。
　　于以上兩點各加一小滴三氟乙酸蓋于其上，反應5min后，用吹風機吹熱風2min（熱風溫度低于40℃），再于薄層板上滴加以下兩個點。
　　第三點：10μL（0.04μg/mL）黃曲霉毒素B1標準使用液。
　　第四點：20μL樣液。
　　再展開（見上3）。在紫外光燈下觀察，在黃曲霉毒素B1標準點的相同位置上，樣液也出現藍紫色熒光點為陽性，否則為陰性。未加三氟乙酸的三、四兩點，可依次作為樣液與標準的衍生物空白對照。
　　5． 稀釋定量
　　樣液中的黃曲霉毒素B1熒光點的熒光強度如與黃曲霉毒素B1標準點的最低檢出量（0.0004μg）的熒光強度一致，則樣品中黃曲霉毒素B1含量即為5μg/kg。如樣液中熒光強度比最低檢出量強，則根據其強度估計減少滴加微升數或將樣液稀釋后再滴加不同微升數，直至樣液點的熒光強度與最低檢出量的熒光強度一至致為止。滴加式樣如下：
　　第一點：10μL（0.04μg/mL）黃曲霉毒素B1標準使用液。
　　第二點：根據情況滴加10μL樣液。
　　第三點：根據情況滴加15μL樣液。
　　第四點：根據情況滴加20μL樣液。
　　6． 計算
　　式中：X2——樣品中黃曲霉毒素B1的含量，μg/kg；V1——加入苯-乙腈混合液的體積，mL；V2——出現最低熒光時滴加樣液的體積，mL；m——加入苯-乙腈混合液溶解時相當樣品的質量，g；0.0004——黃曲霉毒素B1最低檢出量，μg。
　　五、 總結及注意事項
　　（一） 本實驗只有在實驗室內沒有揮發性試劑時，才能進行操作。或者在點樣（只能暴露點樣面積）時及展開并干燥以后，在薄層板的上面放1塊潔凈的玻璃板保護吸附層。
　　（二） 薄層板在暴露于紫外光之前要始終保持干燥。當吸附劑表面接觸太陽光或熒光燈的紫外光線（尤其是存在溶劑）時，紫外光級催化所檢驗的化合的發生變化。為了顯色，要避免未展開的斑點接觸紫外光線。
　　（三） 如環境比較潮濕，薄層板的活性易降低，將影響測定的靈敏度。因此，應在使用當天活化，且點板也宜在有硅膠干燥劑的展開槽內進行。
　　（四） 由于黃曲霉毒素B1劇毒并強致癌，操作時應特別小心，注意防護及清洗消毒。受污染的器皿，經次氯酸鈉溶液（5%）浸泡片刻后再清洗干凈即可達到去毒效果。中國糧油儀器在線 http://www.jiansheschool.com